Molekularne podłoże zaburzenia ekspresji betaglikanu w raku endometrium

Abstract

Rak endometrium jest jednym z najczęściej diagnozowanych ginekologicznych nowotworów złośliwych na świecie i dotyczy przede wszystkim kobiet w wieku około- i pomenopauzalnym. W populacji polskiej zajmuje on czwartą pozycję pod względem zachorowalności wśród chorób nowotworowych, a liczba jego przypadków uległa podwojeniu w ciągu ostatnich dekad. W związku z postępującym starzeniem się społeczeństwa polskiego, na co wskazują dane statystyczne, w najbliższej przyszłości należy spodziewać się znacznego wzrostu liczby nowych przypadków zachorowań na ten typ nowotworu. Obowiązująca klasyfikacja kliniczno-patologiczna wyróżnia w obrębie nowotworów endometrium dwa typy, tj. raki endometrioidalne oraz nieendometriodalne. Pierwszy z nich obejmujący przede wszystkim gruczolakoraki endometrium stanowi najliczniejszą grupę pod względem częstości występowania, wynoszącą 75%-85%. Pomimo korzystnego rokowania dla tego typu nowotworu, śmiertelność nim powodowana uzależniona jest od stopnia zaawansowania procesu nowotworowego. W przypadku stadiów zaawansowania FIGO I wynosi ona ok. 20%, podczas gdy w stadium FIGO IV jest to aż ok. 75%. Pomimo postępu w dziedzinie biomedycyny brak jest ciągle dobrze zdefiniowanych markerów molekularnych mogących stanowić uzupełnienie klasycznych metod obrazowania, bądź służących monitorowaniu przebiegu procesu leczenia raka endometrium. Liczne badania wskazują na kluczowe znaczenie sygnalizacji indukowanej transformującymi czynnikami wzrostu typu β (TGFβ) zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologiach człowieka. Kaskada sygnalizacyjna TGFβ aktywowana jest przez liczną rodzinę białek o aktywności cytokin, co znajduje odzwierciedlenie w modulacji różnorodnych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie, ruchliwość, adhezja, angiogeneza, odpowiedź immunologiczna czy apoptoza. W literaturze opisano znaczącą rolę tych czynników w procesie transformacji nowotworowej, gdzie ujawnia się ich plejotropowy charakter. We wczesnych stadiach karcynogenezy ograniczają one proliferację komórek nowotworowych, podczas gdy w późniejszych etapach przyczyniają się do progresji guza oraz jego przerzutowania. Sygnalizacja za pośrednictwem TGFβ możliwa jest dzięki obecności w błonie komórkowej dwóch typów receptorów, tj. TGFβ typu I i TGFβ typu II, wykazujących aktywność kinaz serynowo/treoninowych. Ponadto modulacja sygnału w kaskadzie jest regulowana za pośrednictwem receptorów pomocniczych, określanych w literaturze jako receptory TGFβ typu III. Funkcją receptorów pomocniczych, do których należy betaglikan, jest prezentowanie czynników TGFβ ich receptorom TGFβRI i TGFβRII. Zainicjowany zewnątrzkomórkowo sygnał przekazywany może być do wnętrza komórki na drodze kanonicznej, tj. Smad-zależnej lub w sposób niekanoniczny na skutek interakcji z białkami efektorowymi innych szlaków sygnałowych w komórce. Celem niniejszej pracy była ocena ekspresji betaglikanu oraz identyfikacja potencjalnych mechanizmów molekularnych mogących wpływać na jej zaburzenie w raku endometrium. Analizie poddano metylację regionu promotorowego genu TGFBR3, transkrypcyjną regulację ekspresji betaglikanu przy udziale czynnika GATA3, w tym metylację regionu promotorowego genu GATA3, utratę heterozygotyczności (LOH) w locus genu kodującego betaglikan oraz polimorfizm pojedynczych nukleotydów (SNP) w genie TGFBR3. W badaniach wykorzystano techniki z zakresu biologii molekularnej i genetyki w tym reakcję PCR w czasie rzeczywistym z użyciem sond fluorescencyjnych TaqMan®, Western blotting, metylospecyficzną reakcję PCR oraz analizę długości fragmentów reakcji PCR przeprowadzoną w automatycznym sekwenatorze DNA. Łącznie przebadano 133 przypadki raka endometrium, 69 preparatów prawidłowego endometrium oraz 248 preparatów krwi obwodowej pochodzących od kobiet, u których niezdiagnozowano choroby nowotworowej. Materiał badawczy otrzymano w ramach współpracy z prof. dr. hab. Andrzejem Semczukiem z II Katedry i Kliniki Ginekologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie oraz współpracy prof. dr hab. Magdaleny Bryś (Katedra Cytobiochemii UŁ) z prof. dr. hab. Andrzejem Bieńkiewiczem oraz dr Katarzyną Wójcik-Krowirandą z Katedry Ginekologii Onkologicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Uzyskane wyniki wskazują na istotne statystycznie obniżenie ekspresji betaglikanu w 100% przypadków raka endometrium w odniesieniu do materiału prawidłowego, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Obserwowany spadek poziomu ekspresji tego receptora pomocniczego szlaku TGFβ w raku endometrium wydaje się mieć związek z występowaniem różnorodnych zdarzeń molekularnych, a ich charakter determinowany jest cechami osobniczymi. Stwierdzono, że obniżenie ekspresji betaglikanu w raku endometrium może być wynikiem zarówno utraty heterozygotyczności w locus genu TGFBR3, jak i metylacji w regionie jego promotora proksymalnego czy modulowania jego transkrypcji, której pośredniczy czynnik GATA3. Ponadto, w raku endometrium polimorfizm pojedynczych nukleotydów genu TGFBR3 może mieć także wpływ na składanie i stabilność jego transkryptu. Postępujący wraz ze stadium zaawansowania procesu nowotworowego endometrium spadek ekspresji betaglikanu może skutkować zmianą funkcji szlaku TGFβ z supresorowej na promującą progresję i przerzutowanie nowotworu. Dodatkowo obserwowane zmiany molekularne mogą przyczynić się do zaburzenia sygnalizacji TGFβ, zakłócając równowagę pomiędzy sygnalizacją kanoniczną i niekanoniczną.

Endometrial cancer is one of the leading gynecological malignant tumor occurring in women in their menopausal and postmenopausal age. In polish population its incidence rate takes the fourth position among other cancer related diseases. The total number of new cases has doubled since the last three decades as it is observed in Poland. Due to the progressive ageing of the polish society, the substantial increase of endometrial cancer incidence rate in the near future may be expected. The current clinico-pathological classification of endometrial cancer includes two types, i.e., type I – endometrioid and type II nonendometrioid cancers. Endometrial cancer type I is mostly diagnosed as endometrial adenocarcinoma with 75%-85% incidence. Despite favorable prognosis for the patients with endometrial cancer its related morbidity is strongly associated with diagnosed cancer aggressiveness. Thus, in the case of cancers classified as FIGO I stage it is about 20%, whereas in the most advanced stage FIGO IV it reaches even 75%. Regardless the advancement in the current biomedicine, there is still the lack of well-defined molecular marker, which could serve in diagnosis or the evaluation of the effectiveness of anticancer therapy. Numerous studies indicate the crucial role of the cellular signaling induced by transforming growth factor β type (TGFβ) in human both physiological and pathological conditions. TGFβ signaling cascade is activated by the diverse set of cytokines what can be observed in modulation of different physiological processes, such as cell proliferation, differentiation, migration, cellular adhesion, angiogenesis, immunological response or apoptosis. According to the literature data TGFβ pathway plays a pleiotropic role during neoplastic transformation. In the early stages of carcinogenesis TGFβ acts as a suppressor of cancer cell proliferation, whereas in the more advanced stages it promotes tumor progression and metastasis. TGFβ signaling requires the activity of two types of serine/threonine transmembrane receptor kinases, i.e., TGFβ receptors type I and type II. Moreover, it can be modulated by transmembrane or membrane bound accessory receptors which are termed as TGFβ receptors type III. The accessory receptors, which are represented by betaglycan, are responsible for TGFβ ligand presentation to the TGFβ receptors type I and type II. After extracellular initiation, induced signal is transmitted to the cytoplasm in either Smad-dependent or Smad–independent rout due to the interactions with effector proteins of other signaling pathways. The aim of the current study was the evaluation of betaglycan expression and the identification of potential molecular mechanisms responsible for its alterations in endometrial cancer. The analysis included methylation of TGFBR3 promoter region, betaglycan transcriptional regulation mediated by transcription factor GATA3 and methylation of GATA3 promoter region, loss of heterozygosity (LOH) in TGFBR3 locus and TGFB3 polymorphisms. Following molecular and genetic methods, i.e., real-time PCR with fluorescent TaqMan® probes, Western blotting, methylation specific PCR and PCR products length analysis in DNA sequencer were applied in this study. The study group consisted of 133 endometrial cancer samples, 69 normal endometrial tissue samples and 248 peripheral blood samples. Collected tissue samples were obtained due to the collaboration with professor Andrzej Semczuk from IInd Department of Gynecology, Lublin Medical University and due to the collaboration between professor Magdalena Bryś from the University of Lodz with professor Andrzej Bieńkiewicz and doctor Katarzyna Wójcik-Krowiranda from Department of Gynecology, Medical University of Lodz. Obtained results indicate that betaglycan mRNA and protein expression was significantly downregulated in 100% of studied endometrial cancer samples comparing to the normal tissue. Observed decrease seems to be associated with various molecular mechanisms, and their nature is determined by individual diversity among patients. As it has been shown, the molecular mechanisms responsible for betaglycan loss in endometrial cancer include the loss of heterozygosity in TGFBR3 gene locus, methylation of TGFBR3 gene proximal promoter, as well as transcriptional modulation mediated by GATA3 transcription factor. Furthermore, single nucleotide polymorphisms in TGFBR3 gene may have also potential impact on betaglycan transcript processing and stability in this tumor type. Betaglycan gradual decrease of expression associated with cancer development can be responsible for the switch of TGFβ cascade function from tumor suppressive to promoting cancer progression and metastasis. Furthermore, observed molecular changes may certainly deregulate TGFβ induced signal transmission resulting in interruption of equilibrium between TGFβ canonical and non-canonical pathways.