Poli(A) polimeraza PAPI jako potencjalne miejsce docelowe dla nowych leków przeciwgruźliczych

Abstract

Mycobacterium tuberculosis to najgroźniejszy bakteryjny patogen człowieka odpowiedzialny w skali globalnej za 1,5 mln przypadków śmiertelnych każdego roku. Z drugiej strony gruźlica wywołana przez lekowrażliwe szczepy M. tuberculosis jest chorobą w pełni uleczalną choć wymagającą przeprowadzenia aż sześciomiesięcznej terapii z równoczesnym stosowaniem w początkowej fazie (2 miesiące) „koktajlu” czterech a następnie 2 leków przeciwprątkowych. Niezwykle istotnym problemem epidemiologicznym stają się prątki gruźlicy oporne na leki, szczepy wielolekooporne, o rozszerzonej lekooporności czy wręcz oporne na wszystkie znane dotychczas tuberkulostatyki. Wywołana przez te szczepy wielolekooporna gruźlica, identyfikowana w wielu krajach na całym świecie, stanowi o konieczności poszukiwania nowych skutecznych leków przeciwgruźliczych, które pozwoliłyby na efektywniejsze leczenie gruźlicy lekowrażliwej oraz umożliwiły efektywne leczenie gruźlicy wielolekoopornej. Ograniczona liczba miejsc docelowych w komórkach prątków gruźlicy rozpoznawanych przez stosowane obecnie leki przeciwprątkowe wskazuje na konieczność poszukiwania alternatywnych tarcz molekularnych dla leków przeciwprątkowych nowej generacji. Nowych miejsc docelowych dla potencjalnych leków przeciwprątkowych należy poszukiwać wśród białek niezbędnych dla przeżycia M. tuberculosis w warunkach in vitro i/lub w zakażonym organizmie. Wśród genów wskazywanych jako niezbędne do wzrostu prątków gruźlicy, zidentyfikowanych w badaniach przesiewowych z wykorzystaniem mutagenezy transpozonowej, znalazł się gen pcnA kodujący homolog białka poli(A) polimerazy (PAPI) z E. coli. Poliadenylaza PAPI odpowiedzialna jest za syntezę sekwencji poli(A) na 3’ końcu transkryptów zarówno u organizmów prokariotycznych jak i eukariotycznych. Uważa się, że poli(A) polimeraza uczestniczy w globalnej regulacji poziomu transkryptów w komórce. Głównym celem niniejszej pracy była molekularna ocena możliwości wykorzystania produktu genu pcnA jako potencjalnego miejsca docelowego dla nowych leków przeciwgruźliczych oraz jego charakterystyka funkcjonalna u mykobakterii. Realizacja celu pracy nastąpiła poprzez ocenę niezbędności PAPI w komórkach prątków oraz uzyskanie warunkowego mutanta M. smegmatis charakteryzującego się obniżoną ekspresją białka PAPI. Ponadto uzyskano rekombinowane białko PAPI i opracowano test enzymatyczny pozwalający na ocenę jego aktywności, również w obecności potencjalnych inhibitorów. Zarówno w komórkach bakteryjnych jak i w warunkach in vitro wykazano bezpośrednie interakcje białka PAPI z białkami systemu naprawy DNA poprzez łączenie niehomologicznych końców (NHEJ) oraz zmapowano miejsca wiązania pomiędzy badanymi białkami. Ponadto wykazano zdolność wiązania mykobakteryjnego białka PAPI do jedno- i dwuniciowego DNA oraz do tworzenia kompleksów PAPI z białkiem Ku na podwójnej nici DNA. Analizy mutanta M. smegmatis charakteryzującego się obniżonym poziomem ekspresji białka PAPI wykazały jego zwiększoną wrażliwość na wybrane czynniki mutagenne takie jak: promieniowanie UV, chlorowodorek hydroksyloaminy oraz mitomycyna C. Uzyskane w trakcie realizacji niniejszej pracy doktorskiej wyniki wskazują, iż mykobakteryjne białko PAPI posiada aktywność poli(A) polimerazy, jest niezbędne do wzrostu mykobakterii w warunkach in vitro i może być rozważane jako miejsce docelowe dla nowych leków przeciwprątkowych. Opracowany test aktywności poliadenylazy in vitro, oraz uzyskany rekombinowany szczep M. smegmatis o obniżonym poziomie ekspresji białka PAPI, stanowią model genetyczny do weryfikacji potencjalnych inhibitorów mykobakteryjnej poli(A) polimerazy. Uzyskane wyniki wskazują również na zaangażowanie białka PAPI w procesach naprawy DNA u prątków.