Właściwości fizyko-chemiczne wybranych 8-azapuryn oraz specyficzna rybozylacja 2,6 – diamino-azapuryny przez fosforylazę nukleozydów purynowych

Abstract

Równowaga tautomeryczne form aminowych 2,6-diamino-8-azapuryny, 8-aza-izo-guaniny oraz 8-azaguaniny została wyznaczona za pomocą obliczeń DFT na poziomie B3LYP/6311+G(d,p) oraz BHandHLYP/cc-pVTZ. Najbardziej prawdopodobny tautomer 2,6-diamino-8-azapuryny jest protonowany w pozycji N(9), co jest zbieżne z wynikami dostępnymi danymi eksperymentalnymi. Tautomer o najniższej energii swobodnej 8-aza-izo-guaniny jest protonowany w pozycjach N(3) i N(8). W przypadku ważniejszego biologicznie tautomeru N(9)-H prawdopodobieństwo protonacji w pozycji N(3) jest wyższe niż w N(1). Ten wynik, obserwowany również dla izo-guaniny, pokazuje odwrócone prawdopodobieństwo protonacji w pozycjach N(3) i N(1) w porównaniu z guaniną, a więc efekt mutacji izocytozyna->tymina, zaobserwowany dla alternatywnego kodu genetycznego, może również mieć miejsce w przypadku, kiedy izo-guanina zostanie zastąpiona 8-aza-izo-guaniną. Wyraźnie dominującym tautomerem 8-aza-guaniny jest forma uprotonowana w pozycji N(1) oraz N(9), co jest zgodne z wynikami otrzymanymi dla guaniny. Zatem guanina może z powodzeniem zostać zastąpiona przez 8-aza-guaninę, ponieważ nie niesie to ze sobą konsekwencji w postaci zaburzenia interfejsu Watsona-Cricka. Obliczone energie stanów wzbudzonych dla 8-aza-izo-guaniny oraz 2,6,-diamino-8-azapuryny pozostają w dobrej zgodności z dostępnymi danymi eksperymentalnymi i wskazują na najbardziej prawdopodobne tautomery, jako te odpowiedzialne za absorpcję. Obraz tautomeryczny 9-metylo-8-aza-izo-guaniny został zbadany również metodami hybrydowej chemii kwantowej (BHandHLYP/cc-pVTZ) oraz dodatkowo metodami kompozytowymi (G3, G4). Najbardziej dominującymi tautomerami są formy amino-oxo, które są protonowane w pozycjach N(1) i N(3). Ta kolejność dominacji jest zgodna z wynikami tautomerii otrzymanych dla 8-aza-izo-guaniny, ale metylacja badanej cząsteczki powoduje znaczny wzrost populacji form amino- enolowych protonowanych w pozycji O(2). Analiza właściwości elektrostatycznych 9-metylo-8-aza-izo-guaniny pokazuje, że dominujące tautomery mają równomierny rozkład ładunku, ale zdecydowana większość wysokoenergetycznych form protonowanych na pierścieniu triazolowym to cwiterjony. Fosforylaza nukleozydów purynowych (PNP) jest enzymem, który katalizuje odwracalny proces konwersji (rybozylacja i fosforoliza) między zasadami nukleinowymi (purynami) i ich nukleozydami. Badania eksperymentalne wykazały, że cielęce PNP rybozyluje analogi purynowe w określonych pozycjach - 2,6-diamino-8-azapuryna w pozycjach 7 lub 8 i 8-azaguanina w pozycji 9 pierścienia triazolowego. Przyczyną tego zjawiska może być różna ekspozycja substratów purynowych na kanał prowadzący do miejsca wiązania. Tę hipotezę zweryfikowano przez zastosowanie technik modelowania molekularnego do dwóch kompleksów analogów purynowych 2,6-diamino-azapuryny - cielęce PNP (kod pdb: 1LVU) i 8-azaguaniny - cielęce PNP (kod pdb: 2AI1). Wyniki uzyskane w połączeniu z metodami chemii kwantowej, dokowania i dynamiki molekularnej wykazały jakościową trafność naszej hipotezy. Energie swobodne wiązania układów białko-ligand pokazały, że najbardziej prawdopodobne mody wiązania eksponują azot N(8) w przypadku kompleksu z 2,6-diamino-8-azapuryną i azot N9 dla kompleksu z 8-azaguaniną w kierunku kanału wiążącego, a także wykluczają ekspozycję N9 dla 2,6-diamino-8-azapuryny i N7 dla 8-azaguaniny, co jest częściowo zgodne z danymi eksperymentalnymi. Innym ważnym wynikiem uzyskanym w tym badaniu jest znacznie większa populacja protonowanej formy kluczowej reszty Glu-201 (ze względu na jej obecność w kieszeni wiążącej), w porównaniu ze standardową protonacją niezwiązanego kwasu glutaminowego w roztworze. Wynik ten w połączeniu z populacjami postaci tautomerycznych obu badanych układów silnie sugeruje, że 2,6-diamino-8-azaguanina i 8-azaguanina są rozpoznawane przez białka odpowiednio ze zdeprotonowaną i protonowaną resztą Glu-201. Porównanie wyznaczonych modów wiązania badanych ligandów z inhibitorami obecnymi w strukturach krystalicznych sugeruje, że modyfikacja inhibitora (S)-PMPDAP, w którym łańcuch 2- (fosfonometoksy) propylowy jest przyłączony w pozycji 8 zamiast w pozycji 9, może zwiększyć jego powinowactwo wiązania się do białka PNP.