Opracowanie i wdrożenie metod badawczych do oceny wpływu materiałów na komórki hodowane w hodowlach 3D, na przykładzie wykorzystania dendrymerów jako nośnika siRNA

Abstract

Najbardziej popularny model hodowli komórkowych, czyli hodowle dwuwymiarowe (2D), nie odzwierciedlają w sposób wystarczający fizjologicznych warunków funkcjonowania komórek. O wiele lepszym modelem są hodowle trójwymiarowe (3D), dlatego też jednym z celów pracy było opracowanie metody hodowli 3D oraz metod badawczych do oceny wpływu materiałów na komórki hodowane w 3D. Ponadto, badano wpływ dwóch rodzajów dendrymerów karbokrzemowych (CBD-1 oraz CBD-2) oraz ich kompleksów z pro-apoptotycznymi siRNA (Mcl-1 oraz Bcl-2) na komórki MCF-7 hodowane zarówno w 2D jak i w 3D. Pomiary potencjału zeta, dichroizmu kołowego, fluorescencyjne z bromkiem etydyny potwierdziły tworzenie się kompleksów dendrymer/siRNA. Badanie elektroforetyczne potwierdziło ochronny wpływ dendrymerów przed degradacją siRNA przez RNazę. Przeprowadzono testy XTT oraz live-dead (analiza cytometryczna), które wykazały, że stosowane dendrymery wpływają na żywotność komórek linii MCF-7 hodowanych w 2D, przy czym im wyższe stężenie dendrymeru tym niższa żywotność. Przyłączenie siRNA zwiększało efekt cytotoksyczny. Bardziej toksyczny okazał się dendrymer CBD-1. Analizy mikroskopowe wykazały, że zarówno CBD-1 jak i CBD-2 transportują siRNA do komórek. Na komórkach linii MCF-7 hodowanych w 3D wykonywano test live-dead (cytometria przepływowa) po 24 lub 48 godzinach inkubacji komórek z wybranymi próbkami oraz po podaniu trzech dawek badanych związków. W przypadku hodowli 3D bardziej toksyczny okazał się dendrymer CBD-2. Najlepsze wyniki z punktu widzenia zastosowania dendrymerów jako nośników siRNA w terapii genowej otrzymano po podaniu trzech dawek CBD-1 w kompleksach z siRNA. Analizy mikroskopowa i cytometryczna potwierdziły transport dendrypleksów do komórek hodowanych w 3D, ale był on mniej efektywny, niż w przypadku komórek hodowanych w monowarstwie.