Paralogi RAD51 w naprawie międzyniciowych wiązań poprzecznych w komórkach raka trzonu macicy

Abstract

Rak błony śluzowej trzonu macicy jest szóstym najczęściej występującym nowotworem wśród kobiet oraz ósmą najczęstszą przyczyną zgonów, z powodu nowotworów, na kontynencie europejskim. Z tego powodu duża część badań naukowych, prowadzonych nad rakiem, jest skupiona na identyfikacji biomarkerów odpowiedzialnych za oporność na działanie leków indukujących międzyniciowe wiązania poprzeczne w DNA. W przedstawionej pracy główną uwagę skierowano na paralogi rekombinazy RAD51, kluczowego białka w mechanizmie HR, który wchodzi w skład maszynerii naprawy międzyniciowych wiązań poprzecznych. Wybór paralogów do badań był związany z brakiem aktualnej wiedzy o ich roli w naprawie międzyniciowych wiązań poprzecznych, w komórkach raka błony śluzowej trzonu macicy po działaniu związku sieciującego DNA. Nadrzędnym celem badań, przeprowadzonych w niniejszej pracy, była ocena wpływu paralogów RAD51 oraz miRNA, wyciszających transkrypty genów RAD51C i SWSAP1, na efektywność naprawy międzyniciowych wiązań poprzecznych w komórkach raka błony śluzowej trzonu macicy, w odpowiedzi na chemioterapię. Materiał badawczy stanowiły dwie linie komórkowe raka błony śluzowej trzonu macicy wykazujące różną wrażliwość na działanie związku wywołującego wiązania poprzeczne – cisplatyny. Zaplanowane w ramach pracy doktorskiej badania skupiły się na zastosowaniu wyciszenia ekspresji paralogów RAD51 i skojarzenia inhibitorów kinazy DNA-PK z inhibicją miRNA, które wyciszają transkrypty paralogów RAD51. Cytotoksyczność związków badano za pomocą testu AlamarBlue. Badanie poziomu i naprawy międzyniciowych wiązań poprzecznych wykonano przy użyciu testu kometowego w wersji alkalicznej. Lokalizację jądrową białek badano przy pomocy mikroskopii konfokalnej. Proces apoprozy oraz poziom stężenia białek w komórce analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Ekspresję genów i miRNA badano przy użyciu metody real-time-PCR. Uzyskane w toku badań wyniki wskazują, że: 1. Paralogi RAD51 uczestniczą w początkowych etapach nacinania usieciowanego DNA w naprawie międzyniciowych wiązań poprzecznych. 2. Wyciszenie genu kodującego białko SWSAP1 i inhibicja miR-125a-5p, który reguluje ekspresję SWSAP1, stały się właściwym podejściem badawczym, prowadzącym do uwrażliwienia komórek opornych na działanie cisplatyny poprzez zaburzenie efektywności działania mechanizmów naprawy międzyniciowych wiązań poprzecznych przed lub na etapie nacinania.