Specyficzność substratowa, aktywność i lokalizacja subkomórkowa ludzkiego białka oporności wielolekowej ABCG2

Abstract

Białko ABCG2 u człowieka funkcjonuje jako transporter wielu substancji o znaczeniu fizjologicznym – metabolitów, składników pożywienia, leków. Celem niniejszej pracy było opracowanie nowej metody badania specyficzności substratowej ABCG2 wobec szerokiej grupy związków naturalnych, która umożliwiałaby identyfikację substratów lub inhibitorów oraz ilościowy opis kinetyki ich oddziaływania z transporterem; zastosowanie techniki obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do badania aktywności transportowej ABCG2 oraz oddziaływań białko-białko i białko-substrat; a także opracowanie opartej o mikroskopię konfokalną metodyki badania przebiegu i mechanizmów internalizacji białek błonowych i określenie związku między przekształceniami strukturalnymi białka ABCG2 a jego lokalizacją subkomórkową. W wyniku przeprowadzonych prac przystosowano metodę derywatyzacji fluorescencyjnej flawonoidów za pomocą estru 2-aminoetylowego kwasu difenyloborinowego (DPBA) do badania aktywności transportowej białka ABCG2 w komórkach ssaczych. Umożliwiło to identyfikację kilkudziesięciu flawonoidów, związków pochodzenia roślinnego obecnych w żywności, jako nieznanych uprzednio substratów lub inhibitorów białka ABCG2. Flawonoid luteolinę zidentyfikowano i opisano jako dobry nowy substrat modelowy do badania aktywności i inhibicji ABCG2. Zastosowano FLIM do czasowo-rozdzielczej dekonwolucji obrazu, co wykorzystano przy pomiarach aktywności ABCG2. Wdrożono również metodę pomiarów Försterowskiego rezonansowego transferu energii (FRET) w celu określania powinowactwa substratu do białka transportowego w żywej komórce. Stosując pomiary FRET-FLIM udowodniono eksperymentalnie oddziaływanie białko-białko między cząsteczkami ABCG2. Dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik obrazowania, opartych o mikroskopię konfokalną, udało się odkryć i scharakteryzować nowe interesujące zjawisko: stymulowaną wiązaniem przeciwciała endocytozę białka ABCG2. W wyniku przeprowadzonych badań udało się wyjaśnić, że w wyniku stabilizacji jednej z możliwych konformacji białka następuje szybka internalizacja kompleksu białko-przeciwciało, zachodząca na drodze endocytozy o mechanizmie mieszanym, częściowo zależnym od klatryny, częściowo od cholesterolu.