Strukturalno-funkcjonalne uwarunkowania akumulacji białek zapasowych w nasionach Pisum sativum var Paloma

Abstract

Double fertilization in Angiosperms gives rise to diploid embryo and (mostly) triploid endosperm. During seed morphogenesis, an embryo undergoes many strictly programmed cell divisions, leading to the formation of cotyledons and roothypocotyl axis. Endosperm, which has a considerably simpler development, becomes a main nourishing tissue for an embryo and, as a rule, degenerates during seed maturation. Suspensor mediating nutrient transfer is a structure which acts as a link between the endosperm and the embryo proper. Besides increased mitotic activity essential for accurate cell number establishment, embryo, suspensor and endosperm development is accompanied by endoreplication, which leads to the multiplication of the nuclear DNA content. The stage at which first polyploid nuclei appear and the dynamics and level of polyploidysation are diverse in different plant species. During seed maturation, the process of genetic material multiplication in embryo cells correlates with the accumulation of storage compounds, such as proteins, carbohydrates and lipids. Seed development ends with cell desiccation, leading to embryo dormancy. This process permits seed dispersal and survival in various environmental conditions. The success of germination and the growth of an early seedling are largely determined by the structural and physiological features of a seed, and specifically, by the quality and quantity of storage compounds assembled in mature cells. During the heterotrophic phase of germination, these compounds are used as building material and energy source for a developing seedling. Thus, their accumulation is crucial for the correct and efficient progress of this complicated process. Some of the structural and physiological alterations that take place in endosperm, suspensor and embryo proper and determine the amount of storage proteins in Pisum sativum var. Paloma seeds were investigated in present research. On the basis of differences in embryo morphology and size, four main developmental stages were distinguished: globular, heart, transitional and cotyledon stage. In the globular stage, praembryo, young, middle and late stages were identified. The heart stage was divided into young and late stages and in the cotyledon stage five developmental phases were distinguished (very young, young, middle, advanced and late). Summary 192 In the selected stages, circadian mitotic activity was measured in both endosperm and embryo proper. This parameter illustrates the dynamics of the development and reveals signaling and regulating mechanisms (directing cellular divisions in both structures), as well as their dependence or autonomy. Research made in early stages of development revealed three periods of increased mitotic activity during a day (in the morning, before and after noon). Since the beginning of cotyledon formation, there is a new circadian mitotic activity rhythm in the embryo: the first period of increased nuclear divisions occurs in the morning hours but the second, much greater fraction of cells divides around noon. In endosperm, divisions of nuclei occur as mitotic waves that proceed along micropylar-chalazal axis. Also nuclei with multiplied DNA content divide during such waves, which indicates the ability of an endosperm to use both cell cycle types (mitotic and endocycle) to intensify tissue growth and expansion. Highly polyploid nuclei located on the chalazal pole divide by amitosis. In contrast to an embryo, it is harder to indicate a repetitive circadian mitotic activity pattern in endosperm. Almost in every developmental stage, the rhythm is diverse and different than that observed in an embryo. Various circadian rhythms of mitotic divisions (despite the close embryo and endosperm contact and nutrient transfer between them) reveal that cell cycle regulating signaling mechanisms are independent and isolated in both structures. Such a separation may result from the need for uniform growth and development of the whole endosperm, but some cell divisions in an embryo allow for the establishment of its characteristic spatial organization. During seed development, mitotic cycle is replaced by endocycle, and as a result, the number of nuclei with different ploidy levels raises in particular seed parts. To establish if there is a direct nuclear DNA content gradient in or among the endosperm, suspensor and embryo proper, dynamics and degree of endoreplication were investigated. DNA content gradient may affect the direction of transfer of nutrients and regulatory substances. Cytophotometry of nuclear DNA contents in endosperm revealed its clear polaryzation, showing nuclear ploidy gradient from 3C on the micropylar pole, to 192C on the chalazal pole. DNA content gradient formation, with constant cyto-nuclear ratio, may be the basis of metabolic and regulatory substances gradient formation in cytoplasm. This could be a prerequisite Summary 193 of properly directed transfer of necessary substances taken from the maternal tissues and transported to the embryo. Suspensor - which consists of four big coenocyts - develops (as in the case of endosperm) earlier than embryo proper. In this structure, endoreplication appears already in the praembryo stage. The dynamics of polyploidisation in both structural parts of suspensor are similar. In the end, nuclei of spherical and elongated coenocyts reach 128-256C DNA levels. Lack of clear nuclear DNA content gradient on the whole suspensor area and characteristic wall ingrowths indicate that the surface of this structure is involved in nutrient uptake from endosperm. Thus, suspensor may have a similar transfer function as the chalazal endosperm pole. Embryo proper (which develops later than suspensor and endosperm), after the period of high mitotic activity, reaches the stage in which polyploidy process begins. In cotyledon parenchyma, the decrease in mitotic index is accompanied by gradual increase in the number of endocycling cells. For the first time, the population of nuclei with increased DNA content (4-8, 8C) appears in the transitional stage, when young cotyledons are clearly visible but hypocotyl-root axis is not clearly distinguished. In late cotyledon stage almost 80% of the cells go through the third round of endoreplication (reaching 16-32C DNA), and about 10% enters the fourth round. In hypocotyl-root axis cells, in which mitotic activity persists the longest, no endopolyploid nuclei are observed at any developmental stages. In late developmental stages, mitotic activity restricted to the hypocotyl-root axis area, epidermis and provascular tissue and the presence of 64C DNA nuclei in cotyledons parenchyma are probably related to the formation of the developmental gradient inside the cotyledons and to the nutrient transfer direction, necessary for the accumulation of storage compounds. Storage proteins in Pisum sativum, vicilin (7S), convicilin (7S) and legumin (11S), are stored in specialized vacuoles called protein bodies. To determine the stage in which storage protein accumulation begins and to establish the spatial pattern of their deposition in an embryo, five zones in cotyledon (bazal, adaxial, central, obaxial and apical) and two in embryo axis (root and shoot zone) were distinguished. In each zone, the number, diameter and the volume of protein bodies were measured in particular embryo developmental stages. It has been established, that in Paloma variety, protein body accumulation begins in an advanced cotyledon Summary 194 stage (when embryo reaches 4 mm in length), and protein bodies are accumulated according to a spatio-temporal pattern, that may reflect the inner gradient of cellular development. Storage of protein bodies begins in the internal part of cotyledons, successively in bazal, central and adaxial zones. Subsequently, this process spreads on the outer parts of cotyledons – abaxial and apical zones and ends in roots and shoots. Accumulation of protein bodies in embryo axis cells, epidermis and provascular tissue, where mitotic divisions and no endoreplication occurs, allows an assumption that there is no limiting DNA content (resulting from successive endocycle rounds) that triggers the beginning of protein synthesis. Moreover, during seed development, the rising number of enlarging protein bodies coexisting with the class of the smallest protein bodies suggests that aggregation of protein bodies in vacuoles is accompanied by continuous production of new protein bodies. To find out if particular types of storage protein appear in particular parts of an embryo simultaneously or successively, electrophoresis of proteins derived from different parts of the embryo was carried out. It was evidenced that vicilin and convicilin, were the first to accumulate followed by legumin. The cause for delay in 11S protein accumulation in relation to 7S protein is not known but may be connected with the sequence of particular types of proteins utilized during germination. Accumulation of the protein bodies in seeds is mostly under transcriptional control, and the time of protein storage is strictly correlated with mRNA level. Transcriptional activity examination in developing seeds revealed that the sequence in which transcription products enter the cells from particular parts of cotyledons correlated with the sequence appearance of protein bodies. Transcriptional activity increases in the nucleolus (indicating higher ribosome production) and in the nucleus, where expression of genes coding particular types of storage protein occurs. Significant increase in the transcriptional activity observed in particular embryo zones, which is consistent with spatial pattern of storage protein accumulation, seems to indicate that an adequate pool of mRNA particles must be assembled, to assure effective storage protein biosynthesis. While in embryo proper transcriptional activity increases during seed development, it does not change in suspensor (in the examined stages) but stays at similar, low level. The relatively insignificant and stable transcriptional activity in Summary 195 suspensor suggests that its metabolism does not play a direct role in storage protein synthesis in an embryo, and its main function is nutrients transport from endosperm. The obtained results precisely illustrate changes in mitotic, endoreplication, translational and transcriptional activities which take place during successive developmental stages of Pisum sativum var. Paloma seeds. They seem to provide an adequate base for further research leading to identification of mechanisms and patterns involved in the formation and development of plant organisms.

W wyniku aktu podwójnego zapłodnienia u roślin okrytonasiennych rozmnażających się płciowo powstaje diploidalny zarodek oraz (najczęściej) triploidalne bielmo. Podczas morfogenezy nasion zarodek przechodzi przez szereg ściśle zaprogramowanych podziałów komórkowych, w wyniku których wyodrębniają się liścienie oraz oś hypokotylowo-korzeniowa. Bielmo, przy znacznie prostszym przebiegu rozwoju, staje się główną tkanką odżywczą zarodka, która w czasie dojrzewania nasion z reguły ulega degeneracji. Strukturą pełniącą rolę łącznika pomiędzy bielmem i zarodkiem właściwym, pośredniczącą w przekazywaniu substancji odżywczych, jest suspensor. Obok wzmożonej aktywności mitotycznej, niezbędnej dla ustalenia odpowiedniej liczby komórek, rozwojowi zarodka, suspensora i bielma towarzyszy proces endoreplikacji, prowadzący do zwielokrotnienia podstawowej zawartości jądrowego DNA. Etap, w którym pojawiają się pierwsze jądra poliploidalne oraz dynamika i poziom poliploidyzacji są zróżnicowane u poszczególnych gatunków roślin. W okresie dojrzewania nasion proces powielania materiału genetycznego w komórkach zarodka może korelować z akumulacją substancji zapasowych w postaci białek, cukrów i tłuszczów. Rozwój nasion kończy się procesem odwodnienia komórek, prowadzącym zarodek w stan uśpienia. Zjawisko to umożliwia rozsianie nasion oraz ich przetrwanie w zmiennych warunkach środowiska. Sukces kiełkowania i wczesnego rozwoju siewki jest w znacznym stopniu zależny od cech strukturalnych nasion oraz ich kondycji fizjologicznej, a w szczególności od jakości i ilości substancji zapasowych zgromadzonych w dojrzałych komórkach. Substancje te w heterotroficznej fazie kiełkowania służą jako źródło energii oraz niezbędnych składników budulcowych dla rozwijających się siewek. Skomplikowany proces ich akumulacji w rozwijających się nasionach powinien więc przebiegać prawidłowo i wydajnie. Przedmiotem badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy były niektóre z tych przemian strukturalnych i fizjologicznych, jakie dokonując się w bielmie, suspensorze oraz w zarodku właściwym warunkują wypełnienie nasion grochu Pisum sativum var. Paloma białkami zapasowymi. Na podstawie różnic w morfologii zarodka oraz różnic w jego wielkości, wyodrębniono cztery główne stadia rozwojowe: stadium globularne, sercowate, przejściowe oraz liścieniowe. W obrębie stadium globularnego wyróżniono stadium prazarodka oraz stadium globularne wczesne, średnie i późne. Stadium sercowate podzielono na stadium wczesne i późne, a w obrębie stadium liścieniowego wyodrębniono pięć etapów rozwoju (bardzo wczesny, wczesny, średni, zaawansowany i późny). W poszczególnych stadiach rozwoju dokonano analizy dobowego rytmu aktywności mitotycznej na terenie bielma oraz zarodka właściwego. Parametr ten obrazuje dynamikę rozwoju oraz ujawnia zależność lub autonomiczność mechanizmów sygnalizacyjnych i regulacyjnych, kierujących podziałami w poszczególnych strukturach. Badania przeprowadzone we wczesnych stadiach rozwoju zarodka wykazały obecność trzech okresów wzmożonej aktywności mitotycznej w ciągu doby (w godzinach rannych, przedpołudniowych i popołudniowych). Odkąd zaczynają kształtować się liścienie, w zarodku ustala się nowy dobowy rytm aktywności mitotycznej: pierwsze nasilenie podziałów komórkowych występuje nadal we wczesnych godzinach rannych, natomiast druga, znacznie większa pula komórek, podlega podziałom mitotycznym w południe. W bielmie, podziały jąder następują jako fale mitotyczne przebiegające wzdłuż mikropylarno-chalazalnej osi tej struktury. Fale takie obejmują również jądra o zwielokrotnionej zawartości DNA i świadczą o zdolności bielma do wykorzystania obydwu typów cyklu (mitotycznego i endocyklu) dla intensyfikacji wzrostu i rozbudowy tej tkanki. Wysoce poliploidalne jądra na biegunie chalazalnym bielma dzielą się amitotycznie. W przeciwieństwie do zarodka, w bielmie trudniej wyodrębnia się powtarzalny wzór dobowego rytmu aktywności mitotycznej. Niemal w każdym stadium rozwojowym wykazuje on pewne zróżnicowanie i odbiega od rytmu występującego w zarodku. Zróżnicowany rytm okołodobowych podziałów mitotycznych (mimo ścisłego kontaktu bielma i zarodka oraz przepływu między nimi substancji odżywczych) wskazuje na występowanie w nich niezależnych i izolowanych mechanizmów sygnalizacyjnych związanych z regulacją cykli komórkowych. Uzasadnieniem takiej izolacji jest potrzeba równomiernego wzrostu i rozwoju całego bielma oraz wybiórczo przebiegających podziałów komórkowych w obrębie zarodka, stwarzających możliwość nadania mu charakterystycznej organizacji przestrzennej. Podczas rozwoju nasion, cykl mitotyczny stopniowo ustępuje miejsca endocyklowi, w wyniku którego - w poszczególnych strukturach nasion - coraz liczniej pojawiają się jądra o zróżnicowanym stopniu poliploidalności. W celu ustalenia czy w obrębie bielma, suspensora i zarodka właściwego lub pomiędzy nimi, tworzy się ukierunkowany gradient zawartości jądrowego DNA mogący mieć wpływ na kierunkowość przepływu czynników regulatorowych lub odżywczych, dokonano analizy dynamiki i stopnia endoreplikacji. Cytofotometryczne pomiary zawartości jądrowego DNA w bielmie wykazały wyraźną polaryzację tej struktury, wyrażającą się gradientem poliploidalności jąder od 3C na biegunie mikropylarnym do 192C na biegunie chalazalnym. Wysoce poliploidalne jądra z bieguna chalazalnego mają dużą powierzchnię, stąd procent ich w stosunku do małych i licznych jąder o niewielkiej poliploidalności jest niski. Kształtujący się w cenocycie gradient zawartości DNA, przy zachowaniu stałego stosunku jądrowo-cytoplazmatycznego, stanowić może podstawę ustalania się w cytoplazmie gradientu stężeń czynników metabolicznych i regulatorowych, warunkując prawidłowo ukierunkowany przepływ niezbędnych dla rozwoju substancji, pobieranych z tkanek rośliny macierzystej i przekazywanych do zarodka. Suspensor - zbudowany z czterech dużych komórczaków - rozwija się (podobnie jak bielmo) ze znacznym wyprzedzeniem w stosunku do zarodka właściwego. Proces endoreplikacji w obrębie tej struktury pojawia się bardzo wcześnie, w stadium prazarodka. Poliploidyzacja jąder w obydwu częściach strukturalnych suspensora odbywa się w podobnym tempie. W końcowym etapie rozwoju, jądra kulistych i wydłużonych komórczaków osiągają 128-256C DNA. Brak wyraźnego gradientu zawartości jądrowego DNA na całym obszarze suspensora oraz obecność charakterystycznych wrostów ścian świadczą, że cała powierzchnia tej struktury zaangażowana jest w pobieranie substancji odżywczych z bielma. Suspensor może zatem stanowić dla zarodka strukturę pełniącą podobną funkcję transferową jak chalazalny biegun bielma. Rozwijający się z pewnym opóźnieniem (w stosunku do bielma i suspensora) zarodek właściwy (po przejściu okresu wzmożonej aktywności mitotycznej) wchodzi w etap, w którym rozpoczyna się proces poliploidyzacji. Spadkowi indeksu mitotycznego w parenchymie liścieni towarzyszy stopniowe podejmowanie przez komórki cykli endoreplikacyjnych. Populacja jąder o zwiększonej zawartości DNA (4-8, 8C) pojawia się po raz pierwszy w stadium przejściowym, w którym wyraźnie zarysowują się młode liścienie, natomiast oś hypokotylowo-korzeniowa nie jest wyraźnie wydzielona. W stadium liścieniowym późnym blisko 80% komórek odbywa trzecią rundę endoreplikacji osiągając 16-32C DNA, natomiast 10% podejmuje endoreplikację po raz czwarty. W komórkach osi hypokotylowo – korzeniowej, w których aktywność mitotyczna utrzymuje się najdłużej, na żadnym z etapów rozwoju nie stwierdzono obecności jąder endopoliploidalnych. Towarzyszące późnym stadiom rozwojowym zarodka ograniczenie aktywności mitotycznej do obszaru osi hypokotylowo-korzeniowej, epidermy i tkanki prowaskularnej, jak również obecność w parenchymie liścieni jąder zawierających do 64C DNA, związana jest prawdopodobnie z kształtowaniem gradientu rozwojowego wewnątrz liścieni i ukierunkowaniem transportu substancji odżywczych, niezbędnych do akumulacji materiałów zapasowych. Białkami zapasowymi u Pisum sativum są magazynowane w wyspecjalizowanych wakuolach w postaci ciał białkowych: wiciliny (7S), konwiciliny (7S) i leguminy (11S). W celu wyznaczenia etapu, w którym rozpoczyna się akumulacja białek zapasowych i ustalenia przestrzennego wzoru wypełniania zarodka gromadzonymi substancjami zapasowymi, dokonano podziału liścieni na pięć stref (bazalną, dośrodkową, centralną, odśrodkową i apikalną), a osi zarodka na dwie (strefę zawiązka korzenia zarodkowego i strefę zawiązka pędu). W każdej z nich dokonano analizy liczby, średnicy oraz objętości ciał białkowych w poszczególnych etapach rozwoju zarodka. Ustalono, że u badanej odmiany grochu, gromadzenie białek zapasowych rozpoczyna się w stadium liścieniowym zaawansowanym (gdy zarodek osiąga długość 4 mm), a ciała białkowe magazynowane są według ustalonego, czaso-przestrzennego wzoru, który może odzwierciedlać skierowany do wnętrza liścieni gradient rozwoju komórek. Akumulacja ciał białkowych rozpoczyna się w wewnętrznej części liścieni kolejno w strefie bazalnej, centralnej i dośrodkowej, a następnie proces ten rozprzestrzenia się na zewnętrzne partie liścieni – strefę odśrodkową i apikalną. Najpóźniej ciała białkowe pojawiają się w korzeniu zarodkowym i w zawiązku pędu. Gromadzenie białek zapasowych w komórkach osi zarodka, epidermy i tkanki prowaskularnej, w których odbywają się podziały mitotyczne bez udziału endoreplikacji pozwala przypuszczać, że w rozwijającym się zarodku nie istnieje graniczna zawartość DNA (wywołana kolejnymi rundami endocyklu) warunkująca początek syntezy białek. Ponadto, współwystępowanie podczas rozwoju nasion coraz liczniejszych ciał białkowych o wzrastających rozmiarach z klasą najmniejszych ciał białkowych sugeruje, że agregacji białek w wakuolach towarzyszy ciągła produkcja nowych ciał białkowych. W celu ustalenia czy poszczególne typy białek zapasowych pojawiają się w poszczególnych obszarach zarodka jednocześnie, czy sukcesywnie, przeprowadzono elektroforetyczny rozdział białek pochodzących z różnych stref zarodka. Badania ujawniły, iż jako pierwsze odkładane są wiciliny i konwiciliny natomiast leguminy magazynowane są w późniejszym etapie rozwoju nasion. Przyczyna opóźnienia akumulacji białek 11S względem 7S nie jest znana, ale może mieć związek z kolejnością wykorzystywania ich podczas kiełkowania. Akumulacja białek zapasowych w nasionach podlega głównie kontroli transkrypcyjnej, a czas ich gromadzenia jest ściśle związany z poziomem mRNA. Analiza aktywności transkrypcyjnej w rozwijających się nasionach wykazała, że kolejność w jakiej komórki z wyodrębnionych stref liścieni wzbogacają się w produkty transkrypcji, koreluje z kolejnością pojawiania się białek zapasowych. Wzrost aktywności transkrypcyjnej zachodzi zarówno w jąderku (wskazując na wzmożoną produkcję rybosomów), jak i w jądrze, gdzie ekspresji ulegają prawdopodobnie geny kodujące odpowiednie rodzaje białek zapasowych. Znaczny wzrost aktywności transkrypcyjnej w poszczególnych strefach zarodka, zgodny z przestrzennym planem akumulacji białek zapasowych, wydaje się odzwierciedlać konieczność wcześniejszego nagromadzenia odpowiedniej puli cząsteczek RNA, w celu zapewnienia efektywnej biosyntezy białek zapasowych. O ile w zarodku właściwym intensywność transkrypcji wzrasta w miarę rozwoju nasion, o tyle w suspensorze (w badanych stadiach), nie podlega równoczesnemu nasileniu i pozostaje na podobnym niskim poziomie. Względnie nieznaczna i stabilna aktywność transkrypcyjna w suspensorze sugeruje, że jego metabolizm nie odgrywa bezpośredniej roli w procesie syntezy białek zapasowych w zarodku, a główną jego funkcją jest transport substancji odżywczych z bielma.

Uzyskane wyniki precyzyjnie obrazują przemiany aktywności mitotycznej, endoreplikacyjnej, transkrypcyjnej i translacyjnej, jakie mają miejsce w kolejnych etapach rozwoju nasion Pisum sativum var. Paloma. Jak się wydaje, mogą one stanowić podstawową bazę informacyjną dla kolejnych etapów badań zmierzających do identyfikacji mechanizmów i szlaków sygnalizacyjnych odpowiedzialnych za kształtowanie i rozwój nowego organizmu roślinnego. Poznanie tych mechanizmów może być istotne dla opracowania nowoczesnych metod genetycznych i biotechnologicznych, prowadzących do wzrostu produktywności biologicznej Pisum sativum, którego nasiona są bogatym źródłem białek o istotnym znaczeniu gospodarczym.