| dc.description.abstract | Pomimo postępu w medycynie, zakażenia wywoływane przez grzyby z rodzaju Candida spp. stanowią wciąż poważny problem epidemiologiczny. Z uwagi na wzrost liczebności populacji osób z czynnikami ryzyka znacznie częściej dochodzi do ciężkich, miejscowych oraz inwazyjnych zakażeń z udziałem tych drobnoustrojów. Z coraz większym przekonaniem zwraca się też uwagę na biofilmowe podłoże zakażeń o etiologii mieszanej grzybowo-bakteryjnej (w tym Candida/Staphylococcus), dodatkowo ograniczające skuteczność konwencjonalnej chemioterapii. W świetle wciąż narastającej lekooporności drobnoustrojów i wyczerpywania się zasobów skutecznych chemioterapeutyków, poszukiwanie uzupełniających/alternatywnych metod leczenia jest konieczne. Pożądane jest nie tylko znalezienie nowych czynników o aktywności biobójczej, ale też takich, które mogą nasilać działanie bójcze i/lub wykazują synergizm z dostępnymi klasycznymi chemioterapeutykami albo też wpływać negatywnie na stopień wirulencji patogenów. Jedną z takich interesujących grup produktów pochodzenia roślinnego, które stały się przedmiotem prezentowanych badań są olejki eteryczne. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa wielu z nich jest znana i opisana, ale nie w takim szerokim ujęciu, jak badano w tej pracy. W związku z powyższym zakres prezentowanych badań można uznać za oryginalny.
Obiektem badań były cztery olejki: melisowy (z Melissa officinalis), geraniowy (z Pelargoniumgraveolens), cytronelowy (z Cymbopogonnardus) i goździkowy (z Eugenia caryophyllata), wybrane w badaniach wstępnych z grupy łącznie 25 olejków i ich składników, jako te, które spełniały kryteria adekwatne do planów badawczych. Realizując główne założenia pracy olejki zbadano pod kątem ich cech farmakodynamicznych, takich jak zależność aktywności biobójczej od stężenia i czasu działania (kinetyka), wystąpienie efektu „poantybiotykowego”, czy częstość selekcji komórek opornych. Zbadano też możliwość „uwrażliwienia” C. albicans działaniem olejków na chemioterapeutyki oraz ich wpływ na cechy fenotypowe determinujące chorobotwórczość drożdżaków. Wśród nich znalazły się takie właściwości, jak integralność osłon komórek, zdolność do zmiany morfotypu, podatność na egzogenny stres oksydacyjny, aktywność enzymatyczna w zakresie enzymów hydrolitycznych i hemolizyn. Oceniono również zdolność olejków do interferencji w proces adhezji i tworzenia biofilmu oraz eradykacji dojrzałego biofilmu jednogatunkowego lub mieszanego – grzybowo-bakteryjnego. Dodatkowym aspektem badań, wydaje się, że o perspektywicznym znaczeniu aplikacyjnym, było też sprawdzenie możliwości rozszerzenia palety wyrobów medycznych, w tym należących do kategorii opatrunków stosowanych do zaopatrzenia ran przewlekle zakażonych, o opatrunki chłonne modyfikowane olejkami eterycznymi. Przesłanką do podjęcia badań w tym zakresie były zachęcające wyniki otrzymane w poprzednich seriach doświadczeń, przede wszystkimwykazana aktywność antyadhezyjna i antybiofilmowa olejków.
W badaniach przeprowadzonych w niniejszej pracy zastosowano szereg metod referencyjnych, ale najczęściej w modyfikacjach własnych dostosowanych do charakteru fizykochemicznego olejków. Posłużyły one w sposób uznanyza najbardziej wiarygodny do oceny wrażliwości drobnoustrojów (metoda dyfuzyjno-krążkowa i mikrorozcieńczeń) na te produkty. Opracowano ponadto, we własnym zakresie, szereg metod służących ujawnieniu aktywności frakcji lotnych olejków i ich zdolności do wzmocnienia działania klasycznych leków. Jak wspomniano wcześniej, bardzo ważną częścią badań była ocena aktywności antyadhezyjnej i antybiofilmowej olejków i to nie tylko wobec populacji jednogatunkowych grzybów czy bakterii, ale również biofilmów mieszanych (C. albicans/S. aureus) tworzonych w ściśle monitorowanych warunkach. W tym miejscu przydatne były znane metody badania fizjologii biofilmów stosowane od wielu lat w macierzystej jednostce, takie jak test redukcji MTT lub XTT, barwienie biomasy zestawem Alamar Blue oraz barwienie biofilmów barwnikami fluorescencyjnymi. Również w tym przypadku zaszła konieczność dostosowania ich do zamierzonych celów, to jest uwzględnienia odmiennych właściwości obiektów badawczych (bakterii i grzybów łącznie), choćby poprzez użycie zestawu barwników fluorescencyjnych – Syto9/Calcofluor White dających możliwość oceny składu i żywotności biomasy grzybowej/bakteryjnej z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej. W wielu przypadkach posłużono się jednak metodą oceny jednostek tworzących kolonie (CFU), a więc metodą bardzo pracochłonną, ale uznaną za „złoty standard” w tego typu badaniach.
Wyniki uzyskane w początkowej fazie badań wyznaczających zakres MIC/MFC/MBC olejków potwierdziły znaczący potencjał terapeutyczny większości spośród nich (25 olejków i ich ważnych składników). Nie było to oczywiście zaskoczeniem, ponieważ olejki już od starożytności aż po XX wiek, były znane z dużego znaczenia i zastosowania prozdrowotnego, wcześniej opartego o empirię bez dokładnej świadomości mechanizmów działania. Dopiero później, w miarę rozwoju nowoczesnej farmakognozji i zastosowania metod analitycznych rozwinęła się bardziej świadoma fitoterapia „etnomedyczna”. Jej niektóre aspekty potencjalnie przydatne w praktyce próbowano ocenić na różnych etapach badań tej pracy.
Po szczegółowej analizie kompletu wyników z badań własnych wykonanych
w powyższym zakresie okazało się, że kierują one szczególną uwagę na niektóre
z olejków – o podobnej aktywności wobec bakterii i grzybów, jako organizmów docelowych, ponadto o nieopisanych w literaturze cechach farmakodynamicznych, jakie zamierzano później ocenić. Na ich podstawie wyciągnięto szereg wniosków inspirujących do przeprowadzenia pogłębionych badań nad wybranymi z nich: melisowym, geraniowym, cytronelowym i goździkowym. Ustalono następnie doświadczalnie, że działanie biobójcze tych olejków jest niezależne od profilu wrażliwości grzybów/bakterii na klasyczne leki, a z uwagi na ich wielokierunkowe działanie i złożony skład, ryzyko wykształcenia oporności jest niskie. Stwierdzono, że olejki te wpływają negatywnie na ujawnienie przez C. albicans ważnych cech ich wirulencji, takich jak aktywność enzymatyczna, tolerancja na egzogenny stres oksydacyjny, stopień „uwrażliwienia” komórek grzybów na działanie czynników destabilizujących osłony, w konsekwencji wzmacniających działanie antymykotyków. Co ważne okazało się też, że subinhibicyjne stężenia olejków zmniejszają siłę adhezji, zdolności inwazyjne Candida (hamowanie tworzenia „germ tubes” i mycelium), a także przeciwdziałają powstawaniu biofilmu C. albicans oraz dwugatunkowego wraz z S. aureus. Ponadto, w połączeniu z danym chemioterapeutykiem olejki osłabiają także synergizm infekcyjny bakterii i grzybów w zakresie lekooporności biofilmu. W badaniach in vitro symulujących kontakt modyfikowanego olejkami opatrunku chłonnego z zakażoną raną, wykazano wyraźną redukcję stopnia przeżywalności depozytu drobnoustrojów wchłoniętych lub naniesionych na powierzchnię opatrunku. Oceniono też skuteczność przeciwdrobnoustrojową olejków w obecności obciążenia biologicznego w postaci surowicy i erytrocytów, wykazując jedynie nieznaczny spadek ich aktywności. Jednocześnie potwierdzono bezpieczeństwo biologiczne olejków w oparciu o wyznaczony wskaźnik indeksu biozgodności (ang. Biocompatibility Index, BI) z zastosowaniem standardowych komórek testowych – fibroblastów mysich linii L929, użytych zgodnie z zaleceniami normy PN-EN ISO 10993-5:2009. BI jest międzynarodowo uznanym miarodajnym markerem przydatności medycznej antyseptyku/wyrobu medycznego mówiącym o wysokiej skuteczności przeciw-drobnoustrojowej i jednocześnie niskim działaniu cytotoksycznym.
Zrealizowane cele pracy pozostają w aktualnym trendzie światowych badań skupionym na poszukiwaniu alternatywnych sposobów zwalczania zakażeń o podłożu biofilmowym. Dzięki uzyskanym zachęcającym wynikom badań laboratoryjnych można sugerować, iż zbadane olejki eteryczne – melisowy, geraniowy, cytronelowy i goździkowy, mogą zostać wpisane na listę miejscowo działających środków przeciwdrobnoustrojowych oczekujących na przeprowadzenie w przyszłości badań przedklinicznych i klinicznych. Niektóre z olejków (niebadanych w niniejszej pracy) są już opisane, jako skuteczne czynniki terapeutyczne w walce z zakażeniami grzybiczymi i grzybiczo-bakteryjnymi u pacjentów onkologicznych, z cukrzycą i/lub należących do innych grup wysokiego ryzyka. Zastępują one lub uzupełniają działanie antybiotyków, które nie są zalecane, np. do stosowania miejscowego w opiece nad raną z infekcją lub zagrożoną infekcją, spełniającą kryteria oceny klinicznej W.A.R. (ang. Wounds At Risk). | pl_PL |
