Enzymy zaangażowane w dojrzewanie 3’ końca tRNA u mykobakterii

Abstract

Ponad połowa tRNA Mycobacterium tuberculosis wymaga dodania terminalnej sekwencji cytozyna-cytozyna-adenina. Proteom mykobakterii musi zatem posiadać enzym o aktywności nukleotydylotransferazy tRNA (dodający CCA). Dojrzewanie 3’ końca tRNA u bakterii odbywa się miedzy innymi przy udziale egzonukleaz z nadrodziny DnaQ. Celem pracy była identyfikacja oraz charakterystyka enzymów uczestniczących w procesie dojrzewania 3’ końca cząsteczek tRNA u mykobakterii. Pierwszy etap pracy obejmował identyfikację enzymu o aktywności nukleotydyloytransferazy tRNA w proteomie mykobakterii. Skonstruowano rekombinowane szczepy M. smegmatis oraz M. tuberculosis charakteryzujące się obniżonym poziomem potencjalnych enzymów CCAMtb oraz CCAMsm. Analiza RNA Seq wykazała akumulację 18 (z 45) rodzajów tRNA. Niedojrzałe cząsteczki tRNA, były silnie poliadenylowane. W celu zbadania czy za zjawisko poliadenylacji transkryptów przy niedoborach enzymu CCAMtb u mykobakterii odpowiada PNPaza, przygotowano szczep o obniżonej ekspresji dwóch genów, ccaMtbCas9 oraz gps1MtbCas9. Analizy RNAseq, wykazały, że zjawisko poliadenylacji transkryptów obserwowane jest wyłącznie dla szczepu o obniżonym poziomie enzymu CCAMtb, w obecności niezaburzonej ekspresji genu gps1. Kolejnym etapem pracy było poznanie funkcji egzonukleaz zaangażowanych w dojrzewanie 3’ końca tRNA u mykobakterii. W tym celu skonstruowano szereg mutantów M. smegmatis pozbawionych funkcjonalnych genów kodujących rnPH, rnT, rnZ1, rnZ2, rnD, oraz oczyszczono rekombinowane białka. Analiza transkryptomiczna wykazała, że w przypadku deplecji RNaz PH i T dochodzi do nadprodukcji wielu rodzajów tRNA w komórkach prątków. Wyniki dowodzą, że Rv3907c pełni u mykobakterii niezbędną funkcję nukleotydylotransferazy tRNA i może być rozpatrywany jako atrakcyjne miejsce docelowe dla nowych tuberkulostatyków. Wykazano, że PNPaza jest odpowiedzialna za poliadenylację transkryptów. Analiza mutantów pozbawionych egzonukleaz wskazała na istotną rolę RNazy T w procesie dojrzewania tRNA.