Identyfikacja niskocząsteczkowych związków hamujących aktywność wybranych enzymów zaangażowanych w metabolizm RNA u Helicobacter pylori

Abstract

The increasing antibiotic resistance of Helicobacter pylori (H. pylori) significantly reduces the effectiveness of eradication therapies and highlights the urgent need to identify novel molecular targets for potential therapeutic substances. This study aimed to characterize selected components of the H. pylori RNA degradosome - polynucleotide phosphorylase (PNPase), the RNA helicase RhpA, and the protein PapS with particular emphasis on evaluating PNPase as a potential therapeutic target. Additionally, the function of PapS in RNA metabolism and its interaction with RhpA were investigated. Recombinant PNPase, RhpA, and PapS were successfully purified. Enzymatic assays for PNPase activity, including RNA polymerization and degradation reactions, were optimized to enable downstream inhibitor screening. The spatial structure of PNPase was resolved, followed by structural-functional analyses and interaction studies of the RhpA-PapS complex. PNPase was shown to form a homotrimeric assembly and to retain enzymatic activity under conditions compatible with high-throughput screening applications. PapS did not exhibit polyadenylation activity toward single-stranded RNA; however, it catalyzed the sequential addition of the 3′-terminal CCA sequence to tRNA, consistent with its role as a CCA-adding enzyme. A transient and moderate interaction between PapS and RhpA was detected. Transcriptomic analysis revealed limited changes in gene expression in the H. pylori G27 Δpnp and ΔpapS strains, whereas deletion of rhpA resulted in extensive transcriptomic remodeling. Although pnp deletion did not abolish bacterial viability, it markedly impaired adaptive capacity. The Δpnp strain displayed reduced tolerance to temperature stress (slower growth at 39°C and decreased survival at 4°C), increased sensitivity to UV-C radiation and oxidative stress, reduced motility and urease as well as catalase activity, while enhanced ability to biofilm complex formation, which needs further study to elucidate the potential mechanism. A four-stage screening strategy for PNPase inhibitors was implemented, integrating in vitro enzymatic assays, qualitative selection steps, and evaluation using bacterial cells. From a library of 8,562 compounds, 23 candidates were selected for further validation. Among them, niclosamide exhibited the most pronounced PNP-dependent activity profile. Collectively, these findings indicate that although H. pylori PNPase is not essential for viability, it represents a central regulatory node in RNA metabolism that governs stress response and adaptive phenotypes. Therefore, PNPase constitutes a rational and promising target for the development of novel antibacterial strategies.

Narastająca lekooporność Helicobacter pylori (H. pylori) na stosowane obecnie antybiotyki ogranicza skuteczność eradykacji, co wiąże się z koniecznością poszukiwania nowych celów molekularnych dla potencjalnych leków. W pracy scharakteryzowano wybrane komponenty degradosomu RNA H. pylori, biorąc pod uwagę ich strukturę i funkcję, a także wzajemne oddziaływania: fosforylazę polinukleotydową PNP (PNPazę), helikazę RhpA oraz białko PapS, ze szczególnym uwzględnieniem roli PNP jako potencjalnego celu terapeutycznego. Określono funkcję PapS w metabolizmie RNA i zbadano występowanie interakcji PapS-RhpA. Oczyszczono rekombinowane białka PNP, RhpA i PapS. Zoptymalizowano testy aktywności PNP (reakcje polimeryzacji i degradacji RNA). Wykazano, że PNPaza występuje w formie trimeru i zachowuje aktywność enzymatyczną w warunkach umożliwiających dalsze badania przesiewowe. PapS nie wykazywało aktywności poliadenylacyjnej wobec jednoniciowego RNA, natomiast katalizowało sekwencyjną dobudowę końca 3′ CCA do tRNA, co wskazuje na funkcję enzymu dobudowującego CCA. Stwierdzono przejściowe, umiarkowane oddziaływanie PapS-RhpA. Analiza transkryptomiczna ujawniła ograniczone zmiany ekspresji w szczepach delecyjnych H. pylori G27 Δpnp i ΔpapS oraz rozległą przebudowę profilu transkryptomicznego w ΔrhpA. Delecja pnp nie wiązała się z obumieraniem komórek, lecz powodowała istotne ograniczenie zdolności adaptacyjnych: obniżenie tolerancji na stres temperaturowy (wolniejszy wzrost w 39°C i słabsze przeżycie w 4°C), wzrost wrażliwości na UV-C i stres oksydacyjny, zahamowanie ruchliwości i aktywności ureazy oraz katalazy. Jakkolwiek delecja pnp wiązała się z nasileniem tworzenia obszaru biofilmu, czego wyjaśnienie wymaga dalszych badań. Zastosowano czteroetapową strategię przesiewową użytych w badaniach inhibitorów PNP łączącą testy in vitro, selekcję jakościową i ocenę działania wobec komórek bakteryjnych. Z biblioteki 8562 związków wyłoniono 23 kandydatów do dalszej weryfikacji, a najbardziej obiecujący profil działania zależny od obecności PNP wykazał niklozamid. Uzyskane wyniki wskazują, że PNPaza H. pylori, mimo że nie jest niezbędna do przeżycia bakterii stanowi kluczowy węzeł regulacji metabolizmu RNA determinujący odpowiedź stresową i fenotypy adaptacyjne bakterii oraz racjonalny cel dla poszukiwania inhibitorów PNP w celach terapeutycznych.