Właściwości biologiczne funkcjonalizowanych krzemionek mezoporowatych typu SBA

Abstract

Mezoporowate nanocząsteczki krzemionkowe są stosunkowo nowymi związkami. Od momentu pierwszej syntezy ich potencjalne zastosowanie upatrywano w unikatowych właściwościach, które wynikają z ich struktury. Krzemionki posiadają mezopory o jednolitej i regularnej wielkości oraz bardzo dużej objętości. Ponadto nanocząsteczki te charakteryzują się regularną wielkością oraz bardzo dużą powierzchnią zewnętrzną. Ich silną bioaktywność wynika z obecności licznych grup funkcyjnych na zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni. Krzemionki mogą być w łatwy sposób modyfikowane. Umożliwia to dołączanie organicznych i nieorganicznych grup, łączników czy całych cząsteczek, które pozwalają osiągnąć pożądane właściwości krzemionek. Szeroka charakterystyka materiałów mezoporowatych przyczynia się do ich lepszego poznania, określenia ich potencjalnego użycia w naukach biomedycznych i wyselekcjonowania najlepszych materiałów do poszczególnych zastosowań. Niniejsza praca jest charakterystyką czterech typów mezoporowatych nanocząsteczek krzemionkowych: SBA-OH, SBA-SH, SBA-NH2 oraz SBA-COOH. Nanocząsteczki te różnią się miedzy sobą grupami powierzchniowymi oraz modyfikacjami organicznymi, a także wielkością porów. Krzemionki te zostały także porównane z krzemionką amorficzną. Celem niniejszej rozprawy było określenie czy i w jakim stopniu modyfikacje organiczne oraz grupy funkcyjne wpływają na właściwości krzemionek. Badano wpływ mezoporowatych nanocząsteczek na czerwone komórki krwi poprzez ocenę stopnia hemolizy w próbkach erytrocytów oraz erytrocytów w obecności albuminy surowicy człowieka (HSA). Określono zdolność krzemionek do adsorbowania hemoglobiny (Hb). Badano również cytotoksyczność krzemionek względem linii komórkowej prawidłowej (B14) oraz linii nowotworowych (HL60, 1301 i BRL) wykorzystując testy MTT oraz AlamarBlue. Kolejnym etapem były badania oddziaływania mezoporowatych krzemionek z białkiem – albuminą surowicy ludzkiej z wykorzystaniem dichroizmu kołowego, gaszenia fluorescencji HSA oraz wolnego L-tryptofanu, a także oznaczenia adsorpcji albuminy. Ostatnim etapem było poznanie właściwości powierzchni krzemionek poprzez badanie rozmiaru porów, ich objętości oraz powierzchni właściwej nanocząsteczek. Ponadto zbadano potencjał zeta oraz za pomocą mikroskopu sił atomowych AFM oraz transmisyjnego mikroskopu elektronowego TEM obserwowano morfologię krzemionek. Wszystkie badania oraz porównanie krzemionek mezoporowatych i krzemionki amorficznej pozwoliły stwierdzić, iż zarówno struktura, jak i modyfikacje organiczne oraz przyłączanie grup powierzchniowych wpływają na właściwości tych materiałów. Znacznie niższa hemo- i cytotoksyczność, a także oddziaływanie z białkiem ukazują przewagę mezoporowatych krzemionek nad krzemionką amorficzną.

Mesoporous silica nanoparticles are relatively new compounds. Since their first synthesis in 1992, their potential use in biomedical science was sought due to their unique properties associated with their structure. Silicates have numerous mesopores of uniform and regular size, as well as a large volume. In addition, these nanoparticles are characterized by a regular particle size and a very large outer surface area. It is worth noting that they exhibit strong bioactivity, which is related to the presence of numerous functional groups on both the external and internal surfaces. Significant is the fact that the silica can be easily modified during or after theirsynthesis. This enables the attaching of organic and inorganic groups, linkers, or whole particles, which can grant the mesoporous silica nanoparticle various desired properties. A wide characterisation of the different mesoporous materials will contribute to their better knowledge, determine their potential use in biomedical sciences and will aid in selecting the best materials for specific applications. This work characterises four types of mesoporous silica nanoparticles: SBA-OH, SBA-SH, SBA-NH2, and SBA-COOH. These nanoparticles vary in surface groups, organic modifications and mesopore size. The SBA-type (mesoporous) silicates were also compared with the amorphous silica. The aim of this work was to determine how modifications and addition of organic functional groups affect the properties of the silicates. The effect of mesoporous nanoparticles on red blood cells by evaluating the haemolytic activity in samples of pure erythrocytes and erythrocytes in the presence of human serum albumin (HSA) was investigated. Moreover, the ability of the silicates to adsorb haemoglobin (Hb) was determined. In this study the cytotoxicity of silica nanoparticles relative to the normal cell line (B14 - Chinese hamster fibroblast) and tumour lines (HL60 – human promyelocytic leukaemia cells, 1301 – T cell lymphoblastic leukaemia, and BRL – Buffalo rat liver cells) were investigated using the MTT and AlamarBlue assays. The next step was to study the interactions between mesoporous silica nanoparticles and protein (human serum albumin) using circular dichroism, 89 fluorescence quenching of free HSA and L-tryptophan and the adsorption of albumin. The final step of the presented work was to determine the surface properties of the silicates: the pore size, their volume and surface area. Furthermore, the zeta potential was measured and the atomic force microscope (AFM) and transmission electron microscope (TEM) were used to observe the morphology of silica. All four types of the tested nanoparticles affect the red blood cells, but at different levels: the silicates with amino groups cause the strongest haemolysis. However, the most harmful was amorphous silica, which even in the lowest concentrations caused high haemolysis. The presence of albumin decreased of haemolysis to the control level (erythrocytes untreated by silicates). The SBA-type silica nanoparticles were toxic to all tested cell lines, but they much less decreased cell viability than the amorphous silica. For mesoporous nanoparticles, it was possible to determine the concentration for which there was no haemo- and cytotoxic effect. This concentration is 100 µg/ml. All mesoporous silica interacted slightly with albumin and adsorbed up to 25% of HSA. The completed investigations have shown that the reduction of haemolytic activity occurs due to the protein corona which is formed on the surface of the silica nanoparticles. For the formation of the protein corona only a certain amount of adsorbed protein (25%) is needed. Covering the surface of the silica nanoparticles by proteins makes that they gain new – better properties. Microscopic observation revealed that the silica nanoparticles had a rod-like shape with clearly visible mesocanals. The silicates aggregated easily. The zeta potential of the mesoporous silica ranged from -5.6 mV for SBA-NH2 to -15 mV for unmodified SBA-OH. This means that any surface modifications contribute to an increase in the zeta potential. The zeta potential of amorphous silica was the lowest and amounted to -17.8 mV. The examination of silica nanoparticles surface evaluated surface area, total pore volume and its diameter. These results were consistent with the values obtained by the team of El Kadib straight after synthesis. This means that the tested silicates are stable and the dissolution process in a buffered saline solution (PBS) or the use of ultrasounds do not affect the surface of the nanoparticles. 90 All the studies and the comparison of mesoporous silica with amorphous silica allow for the conclusion that structure, organic modifications and attachment of surface groups affect the properties of these materials. Significantly lower haemo- and cytotoxicity, as well as slightly increased interaction with the protein show the advantage of mesoporous silica nanoparticles over the amorphous one.