Biodegradacja bisfenolu A z użyciem grzybów strzępkowych Trichoderma atroviride i Umbelopsis ramanniana

Abstract

Celem niniejszej pracy było wyselekcjonowanie szczepów mikroskopowych grzybów strzępkowych zdolnych do eliminacji bisfenolu A (BPA), scharakteryzowanie tego procesu, ocena mechanizmów zaangażowanych w biodegradację BPA i toksyczności produktów rozkładu ksenobiotyku oraz wpływu tego związku na wybrane szczepy grzybowe. W pracy wykorzystano szczepy grzybowe pochodzące z kolekcji kultur Katedry Mikrobiologii Przemysłowej i Biotechnologii UŁ. Drobnoustroje pozyskano ze środowisk zanieczyszczonych różniących się stopniem i rodzajem skażenia. We wcześniejszych badaniach prowadzonych w KMPiB UŁ wykazano potencjał tych mikororganizów do wzrostu w wysokich stężeniach substancji toksycznych oraz biotransformacji ksenobiotyków. W pierwszym etapie pracy doktorskiej zbadano zdolność do eliminacji BPA przez trzydzieści jeden szczepów mikroskopowych grzybów strzępkowych. Hodowle prowadzono przez 7 dni wykorzystując podłoże Sabouraud, a związek toksyczny dodawano w stężeniu wyjściowym 50 mg/l. Jedynie osiem szczepów nie wykazało zdolności do eliminacji BPA, a cztery (spośród 31) szczepów: IM QF 10, IM 6324, IM 6449 i IM 6471, charakteryzowały się efektywną (ponad 80%) eliminacją ksenobiotyku. Dodatkowo sprawdzono wpływ chlorku sodu na wzrost oraz proces degradacji BPA przez wymienione wyżej trzy szczepy grzybowe. Najwyższą zdolność do wzrostu i eliminacji BPA w środowisku zasolonym wykazały szczepy oznaczone symbolami IM QF 10 oraz IM 6471, co zadecydowało o ich wyborze do dalszych badań nad rozkładem BPA. Posługując się metodami klasycznymi oraz technikami biologii molekularnej szczepy IM QF 10 oraz IM 6471 zaklasyfikowano odpowiednio, jako Trichoderma atroviride (typ: Ascomycota, rząd: Hypocreales, rodzina: Hypocreaceae) i Umbelopsis ramanniana (typ: Zygomycota, rząd: Umbelopsidales, rodzina: Umbelopsidaceae). Jak dotąd nie opisano zdolności do degradacji BPA przez szczepy grzybowe zaliczane do tych gatunków. W kolejnej części rozprawy doktorskiej analizowano proces biodegradacji BPA. Opracowano metody do identyfikacji produktów rozkładu badanego ksenobiotyku z użyciem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Analiza chromatograficzna umożliwiła zidentyfikowanie łącznie dwudziestu jeden związków będących produktami degradacji BPA, przy czym wykrycie, zarówno wielopierścieniowych metabolitów, jak i jednopierścieniowych produktów biodegradacji badanego związku było możliwe dopiero po optymalizacji metod chromatograficznych. Dodatkowo analiza z wykorzystaniem substratu znakowanego deuterem pozwoliła na potwierdzenie, iż wykryte metabolity stanowią produkty przekształcania BPA. W oparciu o zidentyfikowane związki chemiczne zaproponowano szlaki degradacji ksenobiotyku przez oba wybrane szczepy. Stwierdzono, że U. ramanniana IM 6471 prowadzi biotransformację BPA z wytworzeniem metoksylowej, etoksylowej i hydroksylowanej pochodnej BPA. Do pierścienia badanego ksenobiotyku mogą zostać dołączone grupy hydroksylowe oraz sulfonowe. Ponadto zaobserwowano tworzenie dimerów kondensacyjnych przez U. ramanniana IM 6471, które ulegały utlenianiu bądź sulfonowaniu. Mechanizm biodegradacji BPA przez T. atroviride IM QF 10 był odmienny. Stwierdzono, że BPA w hodowlach tego grzyba strzępkowego ulega sulfonowaniu, utlenieniu oraz demetylacji. Następnie przekształceniu do kwasu 4 hydroksybenzoesowego i kwasu 3,4 dihydroksybenzoesowego lub 3,4 dihydroksybenzaldehydu. Ponadto prowadzi biotransformację ksenobiotyku z wytworzeniem dimerów kondensacyjnych tego związku. Proponowany szlak degradacji ksenobiotyku wskazuje, iż BPA może ulec również hydroksylowaniu, redukcji do 4-(1-metylo-1-fenyletylo)fenolu oraz mineralizacji. W procesie mikrobiologicznej degradacji BPA często zaangażowane są wewnątrzkomórkowe układy enzymatyczne, zawierające cytochrom P-450. W toku badań zaobserwowano wpływ cytochromu P-450 na kinetykę eliminacji BPA przez U. ramanniana IM 6471. Z kolei w hodowlach T. atroviride IM QF 10 nie wykazano zaangażowania tego układu enzymatycznego na proces degradacji ksenobiotyku. W kolejnym etapie rozprawy doktorskiej oceniono aktywność enzymów ligninolitycznych takich jak: lakaza, peroksydaza manganozależna oraz peroksydaza ligninowa. W hodowlach obu szczepów grzybowych nie wykazano aktywności peroksydazy manganozależnej oraz peroksydazy ligninowej. Odnotowano natomiast aktywność lakazy w hodowlach T. atroviride IM QF 10 i ponad trzykrotnie wyższą aktywność tego enzymu w układach z ksenobiotykiem niż w układach kontrolnych. Na tej podstawie wnioskowano, że badane grzyby charakteryzują się odmiennymi mechanizmami przekształcania BPA. W przypadku U. ramanniana IM 6471 w proces degradacji BPA zaangażowany jest cytochrom P-450, natomiast w hodowlach T. atroviride IM QF 10 wykazano aktywność jednego z enzymów ligninolitycznych. W kolejnym etapie rozprawy doktorskiej wykazano wpływ BPA na oba wybrane szczepy grzybowe. Na podstawie obserwacji mikroskopowych oraz analizy profilu fosfolipidów dowiedziono, iż BPA wywiera niekorzystny wpływ na stan fizjologiczny T. atroviride IM QF 10 i U. ramanniana IM 6471. Toksyczne działanie BPA przejawiało się m.in. w postaci zmiany struktury i płynności błon biologicznych oraz powstawaniem chlamydospor. W wyniku mikrobiologicznego rozkładu BPA przez T. atroviride IM QF 10 i U. ramanniana IM 6471 powstały metabolity o różnej strukturze chemicznej i właściwościach. Stosując komercyjnie dostępne testy toksyczności ostrej Artoxkit M oraz Daphtoxkit F magna oceniono toksyczność produktów rozkładu ksenobiotyku. Wykazano, iż zarówno U. ramanniana IM 6471, jak i T. atroviride IM QF 10 prowadzą degradację BPA z przekształceniem go do mniej toksycznych produktów pośrednich. W prezentowanej pracy doktorskiej po raz pierwszy wykorzystano T. atroviride IM QF 10 i U. ramanniana IM 6471 do degradacji BPA. Oba szczepy grzybowe charakteryzują się złożonym mechanizmem biodegradacji BPA. Mimo niekorzystnego wpływu ksenobiotyku na oba szczepy, prowadzą one do rozkładu badanego substratu oraz detoksykacji i mogą znaleźć zastosowanie w eliminacji tego związku ze środowisk nim zanieczyszczonych.