Molekularne mechanizmy interakcji WP 631 i epotilonu B w komórkach raka jajnika

Abstract

Nowotwór jajnika charakteryzuje się najwyższą śmiertelnością spośród wszystkich nowotworów ginekologicznych. Tak złe statystyki związane są z trudnościami z postawieniem prawidłowej diagnozy oraz częstym rozwojem lekooporności. Czynniki te sprawiają, że choroba wykrywana jest najczęściej w III i IV stopniu zaawansowania, kiedy występują już przerzuty do innych narządów, a dostępne obecnie metody leczenia są nieskuteczne. Z tego względu poszukiwanie nowych i efektywniejszych metod terapeutycznych jest wyzwaniem dla współczesnej onkologii. W niniejszej rozprawie doktorskiej oceniano skuteczność kombinacji WP 631 i epotilonu B (Epo B) w komórkach SKOV-3. WP 631 jest bisantracykliną złożoną z dwóch cząsteczek daunorubicyny połączonych łącznikiem p-ksylenowym, wykazującą plejotropowy mechanizm działania, obejmujący przede wszystkim interkalację do DNA. Jej efektywność w komórkach raka jajnika jest dobrze udokumentowana. Epo B z kolei wykazuje działanie zbliżone do taksanów: stabilizuje mikrotubule i hamuje ich depolimeryzację. Wykazano, że w komórkach raka jajnika epotilony przejawiają wyższą aktywność niż paklitaksel, najczęściej stosowany przedstawiciel taksanów. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było stwierdzenie, czy WP 631 i Epo B, zastosowane łącznie, będą działały skuteczniej niż w przypadku ich pojedynczego podania w komórkach raka jajnika SKOV-3, oraz poznanie molekularnego mechanizmu skojarzonego działania związków. Badania te podjęto w oparciu o dane literaturowe, wskazujące na znaczną przewagę terapii skojarzonej nad monoterapią w leczeniu nowotworu jajnika. Wykazano, że WP 631 i Epo B działają synergistycznie w komórkach raka jajnika, a najbardziej optymalnym połączeniem jest to, w którym stosunek bisantracykliny do Epo B wynosi 1 : 1. Tę kombinację związków stosowano w kolejnych eksperymentach, w których oceniano jej właściwości proapoptotyczne, prooksydacyjne i genotoksyczne. Stwierdzono, że kombinacja WP 631 i Epo B, w większym stopniu niż związki stosowane pojedynczo, indukuje apoptozę w komórkach SKOV-3. Na podstawie analizy aktywności kaspaz -9, -8 oraz -3 wykazano, że połączone działanie związków aktywuje zarówno mitochondrialną, jak i receptorową ścieżkę programowanej śmierci komórki. Udowodniono też, że kombinacja przejawia silne działanie prooksydacyjne, a reaktywne formy tlenu zaangażowane są w jej mechanizm działania. WP 631 i Epo B stosowane w połączeniu generowały również uszkodzenia DNA, znacznie silniejsze niż w przypadku działania związków pojedynczych. Co istotne, genotoksyczne działanie kombinacji okazało się w minimalnym stopniu odwracalne. Uszkodzenia materiału genetycznego powstałe w wyniku działania samego WP 631 czy Epo B były mniej trwałe. Przedstawione wyniki dowodzą, że kombinacja WP 631 i Epo B wykazuje w komórkach SKOV-3 wyższą efektywność niż związki stosowane pojedynczo. W celu poznania molekularnego mechanizmu skojarzonego działania związków przeanalizowano ich wpływ na cykl komórkowy oraz regulujące go białka. Wykazano, że WP 631 nie powoduje zmian w rozkładzie faz cyklu, Epo B działa proapoptotycznie oraz zatrzymuje cykl w fazie G2/M, natomiast kombinacja związków prowadzi do poślizgu mitotycznego, czyli wyjścia komórek z bloku G2/M, oraz ich śmierci na drodze apoptozy. Zahamowanie aktywności białek regulujących cykl komórkowy: cykliny B, cyklinozależnej kinazy 1 (CDK1), EpCAM i HMGB1 za pomocą specyficznych inhibitorów pozwoliło ustalić, że białka HMGB1 i EpCAM nie są zaangażowane w mechanizm działania żadnego ze związków, a kompleks cyklina B/ cyklinozależna kinaza 1 pośredniczy w mechanizmie działania Epo B. Na podstawie analizy PCR stwierdzono ponadto, że kombinacja związków istotnie wpływała także na poziom ekspresji mRNA kodujących analizowane białka. Pod wpływem jej działania ekspresja mRNA kodujących cyklinę B i CDK1 istotnie spadła, co stanowi dowód na wystąpienie poślizgu mitotycznego. Kombinacja związków, w odróżnieniu od WP 631 i Epo B stosowanych pojedynczo, obniżała także ekspresję mRNA kodujących dwie pozostałe proteiny: EpCAM i HMGB1. Są one czynnikami prognostycznymi, których wysoka ekspresja koreluje ze stopniem zaawansowania choroby i złymi rokowaniami. Dlatego też obniżanie ich ekspresji może się przełożyć na lepsze rezultaty terapii. Przeprowadzone eksperymenty dowiodły, że WP 631 i Epo B działają synergistycznie w komórkach SKOV-3, a najefektywniejszym połączeniem jest to, w którym stosunek WP 631 do Epo B wynosi 1 : 1. Wytłumaczeniem wyższego potencjału kombinacji związków jest jej wpływ na białka EpCAM i HMGB1, które pośredniczą w mechanizmie skojarzonego działania WP 631 i Epo B.