Analiza możliwości wykorzystania ciał ketonowych i transferazy bursztynylo-CoA:3-ketokwas-CoA jako potencjalnych narzędzi w terapii raka szyjki macicy w warunkach in vitro

Abstract

Prowadzenie intensywnych badań nad nowotworami prowadzi do stworzenia nowych podejść terapeutycznych, a także modyfikacji już istniejących, głównie w celu zredukowania występujących efektów ubocznych. Coraz częściej podkreśla się także rolę diety jako istotnego czynnika wspomagającego leczenie pacjenta. Badania metabolizmu komórek nowotworowych wykazały zwiększone zużycie glukozy przy równoczesnym utrzymywaniu glikolizy na wyższym poziomie w porównaniu do komórek prawidłowych. Na podstawie tej obserwacji rozpoczęto rozważania nad możliwym ograniczeniem, a nawet całkowitym wyeliminowaniem glukozy z diety pacjentów onkologicznych jako potencjalnej formy terapii wspomagającej, i zastąpienie węglowodanów alternatywnym źródłem energii – ciałami ketonowymi. Ciała ketonowe (aceton, kwas acetylooctowy oraz kwas β-hydroksymasłowy) to grupa metabolitów wykorzystywanych przez organy o dużym zapotrzebowaniu energetycznym, takie jak mózg, serce czy mięśnie szkieletowe. Katabolizm ciał ketonowych scentralizowany jest wokół transferazy bursztynylo-CoA:3-ketokwas-CoA (SCOT, ang. succinyl-CoA:3-ketoacid-CoA transferase) produkowanej przez gen OXCT1 i ograniczającej prędkość ketolizy. Głównym celem badań w niniejszej pracy doktorskiej była analiza roli genu OXCT1 oraz produkowanego przez niego białka – SCOT – w regulacji potencjału metastatycznego komórek raka szyjki macicy HeLa. Dokonano tego poprzez charakterystykę komórek HeLa z wyciszoną monoallelicznie i biallelicznie ekspresją genu OXCT1 i nadekspresją genu OXCT1 w aspekcie potencjału proliferacyjnego, zdolności migracyjnych i inwazyjnych oraz przejścia epitelialno-mezenchymalnego. Ponadto, podjęto próbę przestawienia niemodyfikowanych komórek HeLa na wykorzystywanie ciał ketonowych zamiast glukozy jako źródła energii oraz przeprowadzono analizę wpływu ciał ketonowych na komórki HeLa w zmiennych warunkach glikemicznych. Dodatkowo, zbadano wpływ ciał ketonowych na wybrane modyfikacje potranslacyjne komórek HeLa. Otrzymane wyniki badań pozwoliły na sformułowanie wniosku, iż gen OXCT1 może stanowić potencjalne narzędzie do rozwoju nowych terapii raka szyjki macicy.

The main aim of the research in this doctoral thesis was to analyze the role of the OXCT1 gene and the protein encoded by it – SCOT – in the regulation of the metastatic potential of HeLa cervical cancer cells. This was done by characterizing HeLa cells with a monoallelic and biallelic knockout of the OXCT1 gene and HeLa cells with overexpressed OXCT1 gene in terms of proliferative potential, migration and invasive abilities, and epithelial-mesenchymal transition. In addition, an attempt to switch unmodified HeLa cells to use ketone bodies instead of glucose as an energy source was made, and an analysis of the effect of ketone bodies (β-hydroxybutyrate and acetoacetate) on HeLa cells under variable glycemic conditions was performed. In addition, the effect of ketone bodies on selected post-translational modifications of HeLa cells was investigated. The research was carried out using three research models: HeLa cells with (1) a monoallelic and biallelic knockout of the OXCT1 gene and (2) overexpression of the OXCT1 gene, and (3) HeLa cells cultured under variable glycemic conditions, supplemented with ketone bodies, additionally. As part of the preparation of HeLa cells with monoallelic and biallelic knockout of the OXCT1 gene, an innovative CRISPR/Cas9 genomic editing method was used. The obtained set of cells (HeLa OXCT1 KO) consisted of HeLa WT cells (used as control), HeLa OXCT1+/- cells (with monoallelic OXCT1 knockout), and HeLa OXCT1-/- cells (with biallelic OXCT1 knockout). The second research model – HeLa cells overexpressing the OXCT1 gene (HeLa OXCT1 OX) – was obtained by transfecting HeLa cells with the pIRES expression vector (HeLa pIRES) and the pIRES_OXCT1 expression vector with the inserted amplified OXCT1 gene coding sequence (HeLa pIRES_OXCT1). Unmodified HeLa cells were cultured in culture medium under high glycemic (25 mM glucose), low glycemic (1 mM), and total glucose deprivation (0 mM) conditions with the addition of β-hydroxybutyrate or acetoacetate at appropriate concentrations mimicking the state of optimal and deep ketosis in vivo