Rola przeciwutleniaczy w utrzymaniu struktury i właściwości krwinek czerwonych przeznaczonych do transfuzji

Abstract

In transfusion medicine there is a great requirement for advanced methodologies that could improve the quality and prolong the lifetime of red blood cell (RBC) transfusion units. Research is focused, i. a. on the development of more effective additive solutions producing better storage conditions for red blood cells (RBCs). Antioxidants can protect cells against the damaging effects of ROS and RNS. Therefore, they could be good candidates for the additional components of the existing additive solutions. Studies on the potential application of antioxidants in transfusion medicine during storage of blood components are very limited. Individuals who have cellular, congenital or acquired immunodeficiency should receive irradiated RBC units. γ-irradiation of blood products is currently the only effective way to prevent TA-GvHD. However, the dose of radiation that inactivates immunocompetent donor T lymphocytes can cause undesirable alterations of the RBC properties, leading to lipid peroxidation, damage of the cell membrane and reduced cell deformability. Stored RBCs undergo the time-dependent biochemical, oxidative and morphological changes, forcing the need of the constantly monitored the quality of stored concentrates. So far, the methodology used in blood banks to control the quality of the RBC units is rather poor. The aim of study was to (1) determine the influence of selected antioxidants, quercetin, vitamin C (sodium ascorbate) and Trolox, on biochemical/oxidative changes occurring in stored (4°C) non-irradiated and irradiated (50 Gy) RBCs, (2) to select a compound (or a combination of compounds) providing the best RBC protection during storage, and (3) to determine the best/most reliable parameters reflecting storage lesions (changes) in RBC transfusion units. It was found that in stored non-irradiated and irradiated red blood cells the effects of supplemented quercetin strongly depended on the solvent used. Quercetin had modest antioxidative and protective properties when dissolved in ethanol or it caused oxidative damage to the RBC membrane when dissolved in DMSO. Vitamin C moderately protected RBCs against oxidative stress during storage – vitamin C supplementation in the RBC medium resulted in inhibition of lipid peroxidation and decrease in GSH depletion. On the other hand, increase in extracellular LDH activity and enhanced degree of hemolysis were seen, implying some damage of RBC membranes. Trolox supplemented to the RBC medium showed protective properties – it reduced the permeability of the RBC membrane 115 and showed antioxidative actiont (inhibition of lipid peroxidation, reduction of GSD loss, decrease of LDH leakage and lower degree of hemolysis). There was no significant benefits of the combination of vitamin C and Trolox, at the tested concentrations, compared to the application of vitamin C or Trolox alone. In the discussion section an attempt was undertaken to explain the mechanisms undergoing during RBCs storage (ex vivo aging) in the presence of quercetin, vitamin C or Trolox. It was concluded that among the examined antioxidants Trolox provided the best protection od RBCs during their storage. The parameters that could potentially find application in blood donation and transfusion centers to evaluate the quality of RBC transfusion units may include the measurement of lipid peroxidation, GSH level, TAC, extracellular LDH activity. Application of the flow cytometry methods would be beneficial to assess morphological changes occurring in RBC during storage.

W transfuzjologii nieustannie poszukuje się coraz to nowszych rozwiązań umożliwiających poprawę jakości oraz przedłużenie żywotności koncentratów krwinek czerwonych (KKCz). Badania ukierunkowane są między innymi na opracowanie skuteczniejszych roztworów wzbogacających, w których przechowywane są krwinki czerwone. Dodatkowymi składnikami roztworów wzbogacających mogłyby być związki wykazujące właściwości antyoksydacyjne i chroniące komórki przed szkodliwym działaniem ROS i RNS. Badania nad możliwością stosowania antyoksydantów podczas przechowywania składników krwi są mało zaawansowane. Dla grupy pacjentów z obniżoną odpornością, wrodzoną lub nabytą, napromienianie KKCz jest obecnie jedynym skutecznym sposobem zapobiegania przed TA-GvHD. Jednak dawka promieniowania γ, która inaktywuje limfocyty T może powodować niekorzystne zmiany w RBCs, prowadząc, m.in. do peroksydacji lipidów, uszkodzenia błony komórkowej i zmniejszenia odkształcalności krwinek. Zależne od czasu przechowywania zmiany biochemiczne, oksydacyjne i morfologiczne zachodzące w RBCs wymuszają konieczność stałego monitorowana jakości przechowywanych koncentratów. Jak dotąd, metodyka kontroli jakości KKCz w ośrodkach krwiodawstwa i krwiolecznictwa jest dość uboga. Celem pracy było (1) określenie wpływu wybranych antyoksydantów, kwercetyny, witaminy C (askorbinian sodu) i Troloxu, na zmiany biochemiczne/oksydacyjne zachodzące w przechowywanych (20 dni, w temperaturze 4oC) RBCs nienapromienionych i napromienionych (50 Gy), (2) wyselekcjonowanie związku (kombinacji związków) zapewniającego najlepszą ochronę RBCs podczas przechowywania oraz (3) ustalenie parametrów najlepiej odzwierciedlających zmiany zachodzące w przechowywanych krwinkach. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że w nienapromienionych i napromienionych krwinkach czerwonych przechowywanych w obecności kwercetyny, w zależności od stosowanego rozpuszczalnika obserwowano jej działanie antyoksydacyjne i ochronne (kwercetyna rozpuszczona w etanolu) lub działanie oksydacyjne powodujące uszkodzenie błony (kwercetyna rozpuszczona w DMSO). Witamina C obecna w koncentracie umiarkowanie chroni krwinki czerwone przed stresem oksydacyjnym podczas przechowywania – hamuje peroksydację lipidów i przeciwdziała spadkowi poziomu GSH, ale z drugiej strony w niewielkim stopniu powoduje uszkodzenie błony przechowywanych krwinek – podwyższa pozakomórkową aktywność LDH i zwiększa stopień hemolizy. Trolox jako składnik koncentratu wykazuje właściwości ochronne – ma działanie antyoksydacyjne oraz zmniejsza przepuszczalność błony krwinek (hamuje peroksydację lipidów oraz zmniejsza ubytek GSH, wyciek LDH i stopień hemolizy). Nie wykazano istotnych korzyści z jednoczesnego stosowania witaminy C i Troloxu w badanych stężeniach, w porównaniu z samą witaminą C lub samym Troloxem. W dyskusji podjęto próbę wyjaśnienia mechanizmów zachodzących podczas przechowywania RBCs (starzenia ex vivo) w obecności kwercetyny, witaminy C lub Troloxu. Spośród badanych antyoksydantów najlepszą ochronę podczas przechowywania krwinek czerwonych zapewnił Trolox. Do parametrów, które potencjalnie mogłyby znaleźć zastosowanie w ośrodkach krwiodawstwa i krwiolecznictwa do oceny jakości KKCz można zaliczyć pomiar peroksydacji lipidów, poziomu GSH, TAC, pozakomórkowej aktywności LDH. Zastosowanie metod cytometrii przepływowej byłoby przydatne do oceny zmian morfologicznych zachodzących w krwinkach podczas przechowywania.